南美白對蝦白斑綜合癥病毒的診斷和檢測技術

　　寧波大學海洋與水產系　鄭天倫王國良
　　
　　對蝦白斑綜合癥病毒（WhiteSpotSyndromeVirus，WSSV）也叫白斑綜合癥桿狀病毒（WSBV）、系統外胚層和中胚層桿狀病毒（SEMBV）、日本對蝦桿狀核病毒（RV-PJ）、對蝦桿狀DNA病毒（PRDV）、皮下及造血組織壞死桿狀病毒（HHNBV）、中國對蝦桿狀病毒（PCBV）、淋巴樣細胞核性桿狀病毒（LNBV）（陳秀男等，1994；Wongteerasupaua等，1995；Inouye等，1994、1996；黃倢等，1995a；戰文斌等，1995；陳細法等，1997），是全球對蝦養殖業危害性最大的病毒之一。自1992年WSSV暴發性流行以來，造成了對蝦養殖業的嚴重萎縮。鑒于WSSV尚未有有效的治療方法，快速準確的病原分離檢測技術已成為各國學者研究的焦點之一。

　　1、目視觀察法
　　目視觀察法是通過了解養殖過程中對蝦急性和慢性死亡的情況，結合瀕死對蝦是否具有如頭胸甲出現白斑、甲殼變軟易剝離、蝦體發紅等白斑綜合癥的典型癥狀進行判斷。這種方法可在現場緊急情況下且沒有其他診斷方法可以使用時應用，以便采取搶收措施，減少損失。

　　2、傳統組織學方法
　　即隨機或非隨機從蝦池中取對蝦或對蝦糞便直接作濕標本檢查,配合使用適當的染色技術，在光鏡下進行快速檢測，主要方法有T-E染色法和H-E染色法等。T-E染色法是黃倢等（1995b）首創的一種用于現場檢測的方法，整個過程只需10min左右，具有快速、簡單、方便等優點，但這種方法需要操作者具有較豐富的實踐經驗。值得注意的是，由于某些病毒存在于正常蝦體中使對蝦終生帶毒而不發生病毒病，因此檢測到病毒也不能就一定推斷成對蝦發生了病毒病。

　　3、電子顯微技術
　　電鏡觀察法是最為直觀的檢測病毒性病原的方法，在電鏡下可以直接觀察到病毒的形態和大小。王斌等（1996）、石拓等（1998）分別報道了中國對蝦一種病原病毒負染法電鏡檢測技術，認為負染法可作為對蝦暴發性流行病的診斷方法；張建紅等（1996）描述了一種電鏡診斷快速制樣的方法在對蝦病害檢測中的應用，該法大大縮短了常規制樣法所需時間。其他學者也對對蝦WSSV感染進行了電子顯微鏡觀察（Nunan等，1998；Zhan等，1998）。但電鏡觀察法具有操作復雜、需要較嚴格的實驗條件和較高超的實驗技術、樣品處理時間過長等缺點，不能用于生產實踐中WSSV的快速診斷以及大量樣品的檢測，僅適用于實驗室研究。

　　4、生化檢驗法
　　張呂平等（2000）研究發現，在患病蝦血清中，Ca2+含量明顯上升，患病蝦為15.93mmol/L，健康蝦為10.71mmol/L；而總蛋白（TP）、總磷（PB）及乳酸脫氫酶（LDH）則顯著下降，三者含量依次為52.07g/L、0.34mmol/L及35.27IU/L，在健康蝦個體血清中為66.29g/L、0.66mmol/L和82.36IU/L，可作為斑節對蝦感染WSSV后出現白斑病的主要血清生化特征。可見，通過某些特定生化物質的檢測，在一定程度上可以了解對蝦被病毒感染與否。

　　5、免疫學方法
　　免疫學檢測技術建立在抗原抗體反應的基礎之上，檢測策略靈活性很大，某些方法在快速鑒定應用方面有很大的優勢。
　　酶聯免疫吸附試驗（ELISA）是根據酶免疫測定原理發展的一種固相免疫酶技術，由于具有靈敏度高、操作簡便、重復性好等特點，是應用最廣的免疫學技術。于佳等（1995）研制成功了WSSV單克隆抗體，黃倢等（1995c）則用單克隆抗體ELISA技術提前20-40天對蝦池對蝦的發病可能性作出預報。涂小林等（1996）報道了用純化的病毒免疫兔子，得到了多克隆抗血清，建立了病毒的間接ELISA檢測方法，可在六小時內完成對樣品的檢測，檢測靈敏度達60ng水平。史承銀等（1999）認為，以脫脂奶粉作封閉劑的快速間接ELISA方法具有大大縮短檢測時間、提高檢測靈敏度、降低或消除酶標板“邊緣效應”、降低測試成本等優點，在對蝦病毒檢測的實驗室研究和生產實踐上都具有廣泛的應用前景。汪岷等（2000）通過病毒純化，免疫新西蘭兔，獲得多克隆抗血清，并對抗體進行純化﹑酶標記，建立了雙抗體夾心直接ELISA的檢測方法。
　　Hameed等（1998）用硝化纖維素酶免疫印跡法（NC-EIB）對受WSSV感染的斑節對蝦測得，在對蝦淋巴、眼柄、鰓、頭部軟組織、腹肌和肝胰臟都存在有WSSV，表明該種病毒幾乎存在于所有的組織和器官中。Zhan等（1999a，b）制備了WSSV的單克隆抗體，成功地在中國對蝦體內檢測到了WSSV。

　　6、細胞培養方法
　　細胞培養技術是病毒學研究的基礎，也是用于病毒診斷的基本方法之一。由于病毒有嚴格寄生于活細胞的特性，因此，對蝦細胞培養對于對蝦病毒的研究尤其是對蝦致病病毒的分離和鑒定有重要意義。然而到目前為止，還沒有建立對蝦的細胞系，所有的對蝦細胞培養工作均處于原代培養階段。苗宏志等（2000）為了考察WSSV能否用中國對蝦淋巴器官的原代細胞來分離和繁殖，進行了人工感染實驗。結果證明，中國對蝦的淋巴器官原代細胞完全可用來分離和體外繁殖對蝦WSSV。

　　7、分子生物學方法
　　7.1核酸探針法（DNAprobe）
　　核酸探針是指被某種物質標記了的從而可以被探測到的核酸片段，它能特異性地與待檢測的核酸結合、雜交。張巖等（1995）用Pub18構建了對蝦WSSV的DNA重組質粒，提取后經斑點雜交及酶切分析，證實質粒中插入的片段為病毒DNA。劉萍等（1995）從純化病毒中提取DNA，用限制性內切酶酶切并組裝到質粒上建成WSSVDNA文庫；從中篩選出三個重組質粒，分別用光敏生物素標記做成核酸探針，用于檢測受WSSV感染的對蝦，取得了滿意的結果（劉萍等，1998）。他們研制的WSSV核酸探針試劑盒已經面世。鄧敏等（2000）通過分離純化WSSV粒子，抽提病毒DNA，用限制性內切酶EcoRI酶切后，制備為探針，進行Southern雜交、斑點雜交和原位雜交，其結果證明了克隆片段對WSSV特異，可作為檢測WSSV的方法。徐洪濤等（2000）利用地高辛標記的WSSVDNA探針對病蝦標本及純化DNA進行斑點雜交檢測，均呈陽性反應，而與正常對蝦組織無雜交反應，從分子生物學角度證明了WSSV感染是造成我國養殖對蝦連年暴發流行病的重要原因。雷質文等（2001）和Nunan等（1997）利用PCR法制備了基因探針，用于檢測WSSV。Durand等（1996）也將基因探針作為檢測WSSV的工具。而Chang等（1996）則用原位雜交法對斑節對蝦的WSSV進行了檢測。
　　7.2聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction,PCR）
　　PCR技術的原理是根據已克隆的病毒DNA序列，設計PCR引物，利用該引物直接擴增樣品中待檢測病毒的DNA片段，從而通過電泳、染色把它顯示出來。與傳統診斷方法相比，它具有敏感性及特異性高、簡單、快速等特點，已廣泛應用于WSSV的檢測（桃山和夫，1997；Kim等，1998；Kimura等，1996；Lo等，1996；Mushiake等，2000；Takahashi等，1996）。劉萍等（1999）采用PCR檢測方法，對人工感染親蝦的胃、鰓、卵巢，以及卵和各期幼體進行跟蹤檢測，認為WSSV難以從卵直接向幼體進行傳播。而戰文斌等（2000）用PCR技術對不同生長時期的中國對蝦進行了WSSV的檢測，認為存在由親蝦傳播給蝦苗的感染途徑。石拓等（2000）應用PCR技術分別對暴發性流行病發生前、流行中和發病后的對蝦樣品進行了檢測，結果表明，PCR可以快速、靈敏而準確的檢測WSSV，對病毒病的早期診斷、防治和高健康對蝦品種的選育具有指導意義。目前，國內外均已開發出商品化的WSSV的PCR檢測試劑盒。
　　一些學者還對PCR技術做了不同的改進，使檢測結果更快速、準確。呂玲等（2000）用改進的煮沸法提取病毒DNA，再進行PCR擴增，可節省檢測時間（僅需4h），且敏感性更高，重復性更好。Tang等（2000）采用競爭性PCR法，定量對檢測了受WSSV感染的對蝦血淋巴和頭胸部組織樣品中WSSV的DNA。Lo等（1997）和謝數濤等（2001）分別采用套式PCR對WSSV進行了檢測，結果顯示其靈敏度大約為一步PCR的104倍。夏春等（1999）對WSSV的基因進行了PCR擴增和RFLP分析，建立了PCR法檢測WSSV的方法。
　　7.3隨機擴增多態性DNA技術（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，RAPD）
　　RAPD技術是建立在PCR技術基礎上的新的分子標記技術。其基本原理是采用隨機合成的較短的單個隨機引物，對病毒或其他生物基因DNA進行PCR擴增。將PCR產物進行凝膠電泳形成病毒核酸指紋圖譜，不僅可以檢測同種病毒，還可以進行不同種病毒間DNA序列的同源性比較。孔杰等（1997）已將這一技術應用于對蝦病毒的鑒別。研究顯示，1995年中國對蝦的桿狀病毒與1994年相同，證實這兩年度引起中國對蝦暴發性流行病的病原屬同一種病毒。

　　8、小結
　　綜上所述，對蝦WSSV的診斷研究取得了一定進展。從最初主要依靠組織病理學和透射電鏡觀察來診斷和檢測WSSV，到現在大量采用PCR技術、DNA雜交和免疫學方法，靈敏度、特異性和重復性都有了很大的提高，而且檢測結果更加快速、準確。但以上方法都需要獲得純凈的WSSV，而隨時獲取大量純凈病毒的方式是細胞培養，因此，迫切需要在較短的時間內建立起可以大量繁殖WSSV的適宜細胞株。另外，將各種檢測方法結合使用也可進一步提高靈敏度，如制備DNA探針時，可利用PCR技術使探針量增加（雷質文等，2001；Nunan等，1997）；DNA雜交也可與ELISA結合使用，即采用酶標記探針的方法；PCR技術也可與DNA雜交結合使用，用DNA雜交檢測PCR擴增的結果等。總之，隨著方法的改進，WSSV的檢測將更加直觀、快速、簡便、靈敏和特異。
　　
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